Abertura: O Templo de Chachapoyas (Peru)
Em 1936, o arqueólogo e aventureiro Indiana Jones (Harrison Ford) desbrava um antigo templo cheio de armadilhas no Peru. Ele recupera um ídolo de ouro, mas é confrontado pelo arqueólogo rival René Belloq e pelos nativos Hovito. Cercado e em menor número, Indy entrega o ídolo para Belloq e escapa a bordo de um hidroavião.
Retorno a Marshall College
De volta aos Estados Unidos, Indy leciona na Marshall College. Dois agentes do governo o procuram para uma missão secreta: os nazistas estão atrás da Arca da Aliança, que segundo as escrituras bíblicas conteria "Os Dez Mandamentos" que Deus revelou a Moisés no Monte Horeb. A lenda diz que o exército que a possuir será invencível. Indy é informado de que seu antigo mentor, Abner Ravenwood, possui o bastão de Rá, chave para localizar o Poço das Almas, onde a Arca está enterrada.
A Busca pela Arca
Indy viaja para o Nepal, onde encontra Marion Ravenwood (Karen Allen), filha de Abner e antiga aliada de Indy. Marion possui o bastão de Rá e revela que seu pai foi morto por Belloq. Durante uma conversa em seu bar, o agente da Gestapo Arnold Toht tenta roubar o medallion de Marion, mas é impedido por Indy. O bar é incendiado, e Marion e Indy escapam juntos para o Egito.
O Egito e a Trilha da Arca
No Egito, Indy e Marion se unem ao Marcus Brody e ao Sallah. Eles descobrem que Belloq e os nazistas estão escavando o local do Poço das Almas. Indy e Marion são capturados, mas conseguem escapar. Durante uma perseguição, Indy enfrenta um espadachim habilidoso em um mercado do Cairo. Inicialmente, planejava-se uma elaborada luta de espadas, mas Harrison Ford estava com intoxicação alimentar e não podia lutar. Assim, ele simplesmente atirou no espadachim, criando uma das cenas mais icônicas do filme.
O Poço das Almas
Indy e Marion chegam ao Poço das Almas e descobrem a Arca da Aliança. Belloq e os nazistas os capturam, levando-os para uma ilha no Mar Egeu. Indy ameaça destruir a Arca com um panzerfaust, mas Belloq diz que é um blefe e Indy se rende ao invés de destruir um importante artefato histórico. Indy e Marion são amarrados em um poste para observarem a abertura cerimonial da Arca.
A Revelação da Arca
Belloq realiza uma abertura cerimonial da Arca, que parece conter nada além de areia. De repente, seres fantasmagóricos emergem da Arca. Indy adverte Marion para manter os olhos fechados e não observar o que acontece em seguida. Belloq e os outros olham com espanto para as aparições que são os anjos da morte. Uma vórtice de chamas surge acima da Arca e dispara raios de energia de fogo para os soldados nazistas, matando todos eles. Belloq, Toht e Dietrich todos gritam de terror, e a Arca volta sua fúria sobre eles: a cabeça de Dietrich encolhe, o rosto de Toht é derretido fora de seu crânio e a cabeça de Belloq explode. Chamas, em seguida, engole os restos dos condenados, para salvar Indy e Marion, e a coluna de fogo sobe para o céu. A tampa da Arca é soprada para o alto e depois cai de volta para para a Arca selando-a. Jones e Marion encontram suas cordas queimadas e se abraçam.
O Destino da Arca
Em Washington, D.C., os agentes de inteligência informam a Jones e Marcus Brody que a Arca está em um local seguro e será estudada por "homens". A Arca é mostrada sendo armazenada em um armazém gigante do governo entre inúmeras caixas semelhantes.