Abertura: Um Novo Emprego
O filme começa apresentando Larry Daley (Ben Stiller), um homem divorciado que tem dificuldades em manter empregos estáveis. Larry sonha com grandes oportunidades, mas sua vida profissional é um desastre. Ele quer provar ao filho, Nick Daley (Jake Cherry), que é alguém confiável e que pode ser um bom exemplo. Desesperado por estabilidade, ele aceita trabalhar como guarda noturno no Museu de História Natural de Nova York.
A Primeira Noite
Na sua primeira noite de trabalho, Larry recebe orientações rápidas dos três antigos seguranças que estão se aposentando: Cecil Fredericks (Dick Van Dyke), Reginald (Bill Cobbs) e Gus (Mickey Rooney). Eles lhe entregam um manual, mas não explicam nada de muito concreto. Assim que Larry fica sozinho, ele descobre o inacreditável: durante a noite, as exposições do museu ganham vida graças à Tábua de Ahkmenrah, um artefato mágico egípcio.
De repente, esqueletos de dinossauros, animais empalhados, guerreiros, índios, cavaleiros medievais e até figuras históricas começam a se mover e interagir como se estivessem vivos. Larry entra em pânico, especialmente quando o esqueleto do Tiranossauro Rex o persegue como se fosse um cachorro brincalhão. Ele também tem dificuldades com os miniaturas de caubóis e soldados romanos, liderados por Jedediah (Owen Wilson) e Octavius (Steve Coogan), que vivem brigando entre si.
Conhecendo as Figuras Históricas
Larry começa a explorar o museu durante a noite e conhece várias figuras que ganharam vida:
- Teddy Roosevelt (Robin Williams), o ex-presidente dos EUA em forma de estátua de cera, que se torna um mentor e amigo de Larry.
- Átila, o Huno, que inicialmente parece violento, mas depois demonstra sentimentos humanos.
- Sacagawea, a guia indígena, que chama a atenção de Roosevelt, apesar de ele não ter coragem de se declarar.
- Dexter, o macaco capuchinho travesso, que vive roubando as chaves de Larry e causando confusões.
Roosevelt explica a Larry que tudo ganha vida por causa da Tábua de Ahkmenrah, pertencente ao faraó egípcio Ahkmenrah, que também está entre as exposições, mas trancado em seu sarcófago.
O Caos da Segunda Noite
Determinando a provar que pode controlar a situação, Larry tenta se preparar melhor para a segunda noite. Ele até chama o filho Nick para visitá-lo no museu. No entanto, as coisas novamente saem do controle: os soldados em miniatura destroem partes do museu, o Tiranossauro bagunça os corredores, e Dexter apronta ainda mais. Nick acaba testemunhando o caos, mas, em vez de ficar assustado, acha aquilo tudo maravilhoso.
A Conspiração dos Guardas
Larry descobre que os antigos guardas noturnos — Cecil, Reginald e Gus — planejam roubar a Tábua de Ahkmenrah. Eles sabem do poder do artefato e querem usá-lo para manter vitalidade e juventude. Para isso, eles precisam se livrar de Larry e recuperar a Tábua.
O Despertar de Ahkmenrah
Durante uma das noites, o sarcófago de Ahkmenrah é aberto, e o jovem faraó (Rami Malek) desperta. Diferente de outros, ele é amigável e ajuda Larry a entender melhor a Tábua. Ele explica que a magia só funciona durante a noite, e ao nascer do sol tudo volta ao normal.
A Grande Batalha no Museu
Quando os guardas corruptos roubam a Tábua e tentam fugir, Larry, com a ajuda das figuras históricas, inicia uma grande perseguição dentro e fora do museu. O Tiranossauro, os miniaturas, Átila e até Sacagawea entram na ação para impedir os vilões. Em uma cena de comédia e aventura, todos se unem contra os três ladrões idosos.
Após uma perseguição nas ruas de Nova York, Larry consegue recuperar a Tábua com a ajuda de Jedediah e Octavius, que provam ser aliados leais apesar das brigas constantes.
Conclusão: Orgulho de Pai
Com a Tábua recuperada, o museu volta ao normal. Roosevelt e os outros reconhecem a coragem de Larry. Ele, por sua vez, entende que não precisa ser um grande empresário ou herói famoso para ser importante — basta estar presente e ser responsável, especialmente para seu filho.
Na manhã seguinte, os jornais falam de supostas festas noturnas no museu, já que os visitantes encontram os corredores revirados, mas ninguém imagina a verdade. Nick agora olha para o pai com orgulho, e Larry mantém o emprego como guarda noturno, tendo finalmente encontrado um propósito.
O filme termina com todos os personagens do museu celebrando juntos, enquanto Larry se firma como parte daquela incrível nova família noturna.