Abertura: A Perda de Peter Quill
O filme começa na Terra, em 1988. Um jovem Peter Quill (Wyatt Oleff) vê sua mãe morrer em um hospital vítima de câncer. Devastado, ele foge para fora do prédio, levando apenas um presente misterioso embrulhado que sua mãe havia deixado para ele. Nesse momento de dor, uma nave alienígena surge e o abduz.
Corta para 26 anos depois: Peter (Chris Pratt), agora adulto, vive no espaço sob o codinome Senhor das Estrelas (Star-Lord). Ele se apresenta como um aventureiro e saqueador, mas na prática é um fora da lei associado ao grupo de saqueadores liderado por Yondu Udonta (Michael Rooker).
O Orbe Misterioso
Em uma missão em um planeta abandonado chamado Morag, Peter encontra um artefato esférico conhecido como o Orbe. Ele o rouba, mas logo é atacado pelos soldados de Korath, o Perseguidor (Djimon Hounsou), subordinado de Ronan, o Acusador (Lee Pace), um fanático kree que serve a Thanos. Peter escapa com o Orbe, mas isso o coloca na mira de inimigos poderosos.
A Caçada a Peter Quill
Após o roubo, Yondu descobre a traição de Peter, que guardou o Orbe para si, e coloca uma recompensa por sua cabeça. Paralelamente, Ronan envia a assassina Gamora (Zoe Saldaña), filha adotiva de Thanos, para recuperar o artefato.
Em Xandar, capital da Tropa Nova, Peter tenta vender o Orbe, mas é interceptado por Gamora. Uma luta caótica se inicia nas ruas. Durante a confusão, dois caçadores de recompensas entram em cena: Rocket Raccoon (voz de Bradley Cooper), um guaxinim geneticamente modificado, e Groot (voz de Vin Diesel), uma criatura humanoide em forma de árvore, com vocabulário limitado à frase: “Eu sou Groot”.
Todos acabam sendo capturados pela Tropa Nova e enviados para a prisão de Kyln.
A Prisão de Kyln
Na prisão, os quatro são recebidos com hostilidade. Lá, conhecem Drax, o Destruidor (Dave Bautista), um guerreiro em busca de vingança contra Ronan, responsável pela morte de sua esposa e filha. Drax inicialmente quer matar Gamora por sua ligação com Ronan e Thanos, mas Peter o convence a poupá-la, argumentando que ela pode levá-lo até Ronan.
Rocket organiza um ousado plano de fuga que envolve a ajuda de Groot, que arranca a torre de segurança da prisão. Em meio ao caos, o grupo consegue escapar, roubando uma nave e levando o Orbe consigo.
A Formação dos Guardiões
Os cinco, ainda desconfiados uns dos outros, começam a formar laços. Gamora revela que pretendia trair Ronan e Thanos, entregando o Orbe ao Colecionador, Taneleer Tivan (Benicio Del Toro), para impedi-los de usar o artefato.
Eles viajam até Knowhere, uma estação espacial construída na cabeça cortada de um Celestial.
A Revelação da Joia do Infinito
Em Knowhere, o grupo entrega o Orbe ao Colecionador. Ele revela que dentro do objeto está uma das seis Joias do Infinito, a Joia do Poder, capaz de destruir civilizações inteiras. Durante a explicação, uma das assistentes do Colecionador tenta usar a Joia, causando uma explosão que devasta parte do local.
Nesse momento, o grupo percebe a gravidade do que carregam. Enquanto discutem sobre o que fazer, Ronan chega, atraído pelo poder da Joia.
A Traição e o Poder de Ronan
Ronan ataca Knowhere e toma o Orbe. Em vez de entregá-lo a Thanos, como era o acordo, ele decide usá-lo para si mesmo. Ele incorpora a Joia em sua arma, o martelo Cosmi-Rod, e se torna praticamente invencível.
Gamora quase é morta durante a fuga, mas Peter a salva chamando Yondu e se entregando a ele. Rocket, Groot e Drax tentam resgatar os amigos, e aos poucos, todos voltam a se reunir.
O Plano Contra Ronan
Com Ronan a caminho de destruir Xandar, o grupo decide agir. Peter convence Yondu e seus saqueadores a ajudá-los, prometendo uma oportunidade de glória e saque. Apesar da tensão entre eles, o acordo é feito.
A Tropa Nova também se une ao combate, formando uma grande frota para tentar deter a nave de guerra de Ronan, a Dark Aster.
A Batalha de Xandar
Em uma das maiores batalhas espaciais do Universo Cinematográfico Marvel até então, a Dark Aster invade Xandar. Rocket e os saqueadores enfrentam os caças de Ronan, enquanto Drax e Gamora se infiltram na nave.
Groot se sacrifica para salvar os amigos, envolvendo-os em um casulo de galhos e pronunciando pela primeira vez uma variação de sua frase: “Nós somos Groot”. A nave cai em Xandar, e o grupo confronta Ronan diretamente.
A Força da Amizade
Com a Joia do Poder, Ronan é praticamente indestrutível. No entanto, Peter distrai o vilão dançando de forma ridícula, chamando-o de “desafio de dança”. Isso dá tempo para Rocket consertar uma arma e lançar um disparo que quebra o martelo de Ronan, liberando a Joia.
Peter agarra a Joia, quase morrendo devido à sua energia devastadora. Mas, ao unir forças com Gamora, Drax e Rocket, eles conseguem canalizar o poder juntos, derrotando Ronan e destruindo-o completamente.
A Nova Família
Com a ameaça encerrada, Peter entrega a Joia à Tropa Nova, garantindo a proteção do artefato. Yondu fica com um falso Orbe, mas deixa escapar que sempre teve um carinho especial por Peter.
Na nave, Rocket pega um galhinho sobrevivente de Groot e o planta em um vaso — o futuro Baby Groot.
Peter finalmente abre o presente deixado por sua mãe: um novo Mixtape, com músicas dos anos 70 e 80. Ele coloca a fita no toca-fitas e, junto de seus novos amigos, parte para novas aventuras pelo espaço.