Abertura: O Segredo dos Parker
O filme começa com um flashback da morte misteriosa dos pais de Peter Parker. O cientista Richard Parker e sua esposa Mary Parker fogem em um avião particular após Richard ter descoberto segredos perigosos na corporação Oscorp. Durante o voo, o piloto revela ser um traidor, e ocorre uma luta mortal. O avião cai, matando os dois, mas não antes de Richard gravar uma mensagem em vídeo para explicar sua pesquisa secreta.
Homem-Aranha em Ação
De volta ao presente, vemos Peter Parker (Andrew Garfield) em Nova York, já vivendo intensamente sua vida como o Homem-Aranha. Ele impede um assalto de caminhão conduzido pelo criminoso Aleksei Sytsevich (Paul Giamatti), que mais tarde se tornará o Rinoceronte.
Enquanto luta, Peter precisa se apressar para não perder a cerimônia de formatura de sua namorada, Gwen Stacy (Emma Stone). Ele chega atrasado, mas consegue vê-la discursar como oradora da turma. Apesar da vida heroica, Peter é constantemente assombrado pela lembrança da morte de Capitão Stacy, pai de Gwen, que o fez prometer manter a filha afastada do perigo.
Max Dillon: O Homem Invisível
Na Oscorp, conhecemos Max Dillon (Jamie Foxx), um engenheiro elétrico solitário e desprezado pelos colegas. Ele é um grande fã do Homem-Aranha, a quem idolatra após ter sido salvo por ele em um incidente na rua. Max vive uma vida de anonimato, sofrendo de baixa autoestima e carência de reconhecimento.
Tudo muda quando ele sofre um acidente terrível ao consertar cabos de energia da Oscorp: cai em um tanque cheio de enguias elétricas geneticamente modificadas. O choque quase o mata, mas o transforma em algo sobre-humano, dando-lhe poderes elétricos.
O Retorno de Harry Osborn
Enquanto isso, Harry Osborn (Dane DeHaan), antigo amigo de infância de Peter, retorna a Nova York após a morte de seu pai, Norman Osborn. Harry descobre que herdou a mesma doença genética terminal e busca desesperadamente uma cura. Ele acredita que o sangue do Homem-Aranha pode salvar sua vida.
Harry retoma sua posição de liderança na Oscorp, mas enfrenta hostilidade dos diretores e funcionários da empresa.
O Nascimento de Electro
Após o acidente, Max vagueia pela cidade confuso e instável. Sua transformação o torna capaz de manipular energia elétrica, mas também o torna extremamente instável mentalmente. Quando aparece na Times Square, tentando recarregar sua energia, é cercado pela polícia. O Homem-Aranha chega e tenta acalmá-lo, mas a tensão cresce quando atiradores disparam contra Max, que se sente traído.
A raiva de Max explode, e ele se transforma em Electro, atacando a cidade em uma espetacular batalha de energia. Peter consegue derrotá-lo usando água, e Max é capturado e levado para a instalação secreta da Oscorp, Ravencroft, onde passa a ser estudado e manipulado.
O Amor e a Promessa
Enquanto isso, Peter luta contra seus sentimentos por Gwen. Apesar de ainda a amar profundamente, ele teme que sua vida como Homem-Aranha a coloque em perigo. Gwen, por outro lado, sente-se dividida entre seu amor e a possibilidade de estudar em Oxford, na Inglaterra, para realizar seus sonhos.
A tensão entre os dois cresce, mas eles acabam se reconciliando e se aproximando novamente, demonstrando o quanto se amam.
A Aliança Sombria
Harry Osborn descobre sobre o aprisionamento de Electro em Ravencroft e decide libertá-lo. Em troca, pede ajuda para capturar o Homem-Aranha e conseguir seu sangue. Electro aceita, acreditando que Peter o enganou e é seu verdadeiro inimigo.
Electro invade a Oscorp e ajuda Harry a assumir o controle da empresa. Harry, cada vez mais consumido pela doença e pela loucura, descobre a armadura e a tecnologia secreta de seu pai. Ele utiliza uma fórmula experimental derivada do sangue de aranha, mas a substância o deforma fisicamente e o transforma no novo Duende Verde.
A Batalha Final
Electro inicia um ataque em larga escala, cortando a energia de toda Nova York. O Homem-Aranha precisa enfrentá-lo em uma luta épica na Usina de Energia de Nova York, com Gwen ao seu lado, que insiste em ajudá-lo apesar do perigo.
Com a inteligência de Gwen e a determinação de Peter, eles conseguem sobrecarregar o corpo de Electro, derrotando-o em uma explosão elétrica controlada.
Mas a vitória dura pouco: Harry Osborn surge como o Duende Verde, descobrindo a identidade secreta de Peter. Ele sequestra Gwen e a leva até o topo da torre do relógio para forçar Peter a sofrer.
A Morte de Gwen Stacy
Na batalha desesperada, Peter luta contra Harry enquanto tenta salvar Gwen. Durante o confronto, os mecanismos da torre se quebram, e Gwen despenca. Peter se lança em um salto dramático, disparando sua teia em direção a ela.
Apesar de conseguir alcançá-la, o impacto da queda é fatal. Gwen morre nos braços de Peter, em uma das cenas mais trágicas e marcantes dos filmes do Homem-Aranha.
Devastado pela perda, Peter se afasta completamente da vida de herói, atormentado pela dor e pela promessa que não conseguiu cumprir.
O Legado do Herói
Meses depois, Nova York continua sofrendo com o crime. O criminoso Aleksei Sytsevich retorna, agora equipado com uma armadura blindada de rinoceronte construída pela Oscorp. A polícia é incapaz de contê-lo.
Enquanto isso, um garoto inspirado pelo Homem-Aranha entra em cena com uma fantasia improvisada, enfrentando o perigo em um gesto de coragem. Isso inspira Peter a retornar como Homem-Aranha, percebendo que mesmo na dor, ele tem uma responsabilidade maior.
Ele veste novamente o uniforme e enfrenta Aleksei, balançando-se pelas ruas de Nova York em direção ao combate, encerrando o filme em um momento de esperança.